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固定化及透性化对瑞士乳杆菌L7生产共轭亚油酸的影响

论文作者:www.51lunwen.org论文属性:硕士毕业论文 thesis登出时间:2012-11-27编辑:lgg点击率:7699

论文字数:40000论文编号:org201211241156492564语种:中文 Chinese地区:瑞士价格:$ 33

关键词:固定化透性化瑞士乳杆菌L7亚油酸

摘要:瑞士乳酸菌是一群可发酵碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性细菌的通称,它广泛存在于人、畜、禽类的肠道及多种食品中。乳酸菌属于兼性厌氧菌,培养条件易于控制,且无毒安全。

第1章前言


共轭亚油酸(conjugated linoleic acid, CLA)它是一系列含有共轭双键的亚油酸的位置和几何异构体的混合物的总称。通过动物试验和体外研究,发现CLA具多种生物、药理活性:抗突变、抗癌气提高机体免疫力,防止动脉硬化,抗n型糖尿病,促进骨骼形成及减肥等生理功能。天然CLA主要存在于反当动物的肉和乳制品中且含量很少。居民从食物中平均每日摄入的量远远低于专家建议的每日摄入量,因此向食品中强化CLA不乏是一种有效的摄取途径。目前CLA作为功能性食品添加剂已在欧美、日本等多个国家进行销售。在CLA的多种异构体中,m-CLA和10U2C-CLA被认为是最主要的生物活性单体[8],因而具有广泛的应用前景,是目前研究的热点之一。
目前,制备CLA主要有化学合成法和微生物转化法。与化学合成法相比,利用微生物转化法生产CLA具有很大的优势,它反应条件温和,无毒性,并且产物的异构体组成较单一,与天然食物中CLA异构体组成相似[9],且利于实现生产的连续和产品的开发利用。亚油酸异构酶是一种存在于微生物菌体内的、可以特异性的转化亚油酸为共辄亚油酸的胞内酶,它可来源于多种微生物如乳酸杆菌属Lactobacillu、丁酸弧菌属 CButyrivibfio)、丙酸杆菌属www.51lunwen.org)、真杆菌属(Eubacterium)等。其中 Lactobacillus、Eubacterium、Butyrivibrio 具有产 9c, 11/-CLA的活性,还同时具有12c-CLA的活性。乳酸菌是一种常见的益生菌,可广泛应用于食品、药品、保健品中。乳酸菌是兼性厌氧菌,它的培养条件非常易于控制,且无毒安全,同时乳酸菌含有的亚油酸异构酶对底物具有很强的专一性,利用乳酸菌的发酵作用进行生物转化合成组成较为单一的CLA成为人们热点研究的课题。
由于亚油酸异构酶的稳定性差,复杂的分离纯化工艺会造成酶活性的巨大损失,极大地限制了其在生产中的应用。细胞透性化技术可以克服亚油酸异构酶的提取困难和细胞膜对亚油酸的低通透性问题。固定化细胞技术不但可以使菌体保持其原有的催化活性,还具有易于分离、可重复使用以及稳定性提高等显著的优点。


1.1共辆亚油酸的结构及其生物学功能


1.1.1共辆亚油酸的结构
CLA是由必需脂肪酸亚油酸衍生的共辄双烯酸的多种位置和几何异构体的总称,主要位置异构体包括8,10-、9,11-、10,12-和11,13-四种,每个位置上的空间异构体又有四种(t,t、t,c、和c,c),因此使得CLA的异构体多达几十种。双键的位置不同导致CLA的生物活性也不同。在众多的异构体当中,9c,lU-CLA和10U2C-CLA是公认的生物活性最强的两种。


1.1.2共辆亚油酸的生物学功能
共辄亚油酸(CLA)是存在于食物中的天然成分,Booth (1935)首次证明了反当动物食品中含有共辄亚油酸,Parodi (1977)首次证明9c,llr-CLA的存在。Pariza (1983)等最先发现烧烤牛肉的提取物具有抗癌作用,接着对提取物的分析鉴定确认抗癌成分是共辄亚油酸的混合物,这是首次对CLA的生物作用进行了阐述。因为CLA在瘤胃内容物中的含量较高且常见,因此人们给这些异构体取名为“瘤胃酸”(Kramer等,1998)。在随后的研究中发现含有CLA的日粮能减少实验动物乳腺、结肠及皮肤等部位肿瘤的发生率。
近年来,许多实验研究证明CLA还具有抗糖尿病、减少脂肪沉积、减少动脉硬化、调节免疫系统等生物学作用。目前大多数的研究表明,9C,11M:LA具有较强的抗癌活性,10,12c-CLA具有较强的减肥活性。由于CLA具有这诸多有益的作用,因此在许多领域引起了浓厚的兴趣,不仅使人类营养学家和医疗领域对其产生了广泛地关注,同时也成为动物营养学研究的一个薪新领域。


第2章JL hevelctius L7产共辆亚油酸条件的优化


2.1引言
在CLA的制备方法中,微生物发酵法具有反应条件温和、易于操作和安全高效的优点,越来越受到研究者的青睐。微生物发酵法可直接利用微生物生长代谢过程中产生的亚油酸异构酶,将LA转化为CLA,工艺简单,成本低,且从食品安全考虑,所用菌株L 属于乳酸菌属,为食品发酵常用菌株,兼有安全和高效的优良性能。
本实验室前期分离保藏了一株高产CLA的菌株L. hevelctius L7,本章建立了紫外光谱扫描和高效液相色谱联合检测共辄亚油酸的方法,确定了产物为9c,lU-CLA;对I. L7进行培养,并测定其生长状况和亚油酸异构酶的活性水平,并对菌体生物转化生产CLA的条件进行优化,从而使菌种在最佳的条件下达到最高的产量。


2.2材料试剂与仪器设备


2.2.1实验材料
瑞士乳杆菌L7 (L helveticus L7),本实验室分离保藏。


2.2.2试剂
亚油酸(实验室自制,纯度>95 %)、9c,m-CLA标品,10U2C-CLA标品(南昌华兴生物科技有限公司)、甲醇(HPLC纯)、异丙醇(HPLC纯)、正己焼(HPLC纯)、乙腈(HPLC纯)、乙醚、无水硫酸钠,未注明试剂均为国产分析纯;MRS培养基;憐酸盐缓冲液(PBS),PH=5.8 (0.1 mol/L)。MRS培养基配方:蛋白胨10.0克、牛肉提取物10.0克、酵母膏5.0克、葡萄糖5.0克、硫酸镁0.2克、乙酸钠5.0克、梓檬酸二胺2.0克、憐酸氧二钾2.0


第3章 透性化对L.HEVELCTIUS L7的影响 ...............................32-39
    3.1 引言............................... 32
    3.2 材料试剂与仪器设备............................... 32-33
        3.2.1 实验材料 ...............................32
        3.2.2 试剂............................... 32-33
        3.2.3 仪器设备............................... 33
    3.3 试验方法 ...............................33-34
    3.4 结果与分析............................... 34-38
    3.5 小结............................... 38-39
第4章 透性菌细胞的固定化...............................39-51
    4.1 引言 ...............................39
    4.2 材料试剂与仪器设备............................... 39-40
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