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Evil靶向干预Smad3在白血病细胞分化为单核/巨噬细胞中的医学作用机制研究

论文编号:lw201802282112117641 所属栏目:临床医学论文 发布日期:2018年03月02日 论文作者:www.51lunwen.com
本文是土木工程论文,土木工程(英文:Civil Engineering)是建造各类工程设施的科学技术的统称。它既指所应用的材料、设备和所进行的勘测、设计、施工、保养、维修等技术活动,也指工程建设的对象。即建造在地上或地下、陆上或水中 ,直接或间接为人类生活、生产、军事、科研服务的各种工程设施,例如房屋、道路、铁路、管道、隧道、桥梁、运河、堤坝、港口、电站、飞机场、海洋平台、给水排水以及防护工程等。(以上内容来自百度百科)今天无忧论文网为大家推荐一篇会计论文,供大家参考。

前 言

白血病又称“血癌”,是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。其发病原因是造血细胞的某一系列、主要是某一白细胞系列前体细胞失去分化成熟的能力,在骨髓中或其他造血组织中呈恶性克隆性增生、积聚,并且侵犯肝、脾、淋巴结,最终浸润破坏全身组织、器官,使正常的造血功能受到抑制。白血病与实体肿瘤不同,不是生长在局部的赘生物,而是全身散播,可能侵犯各系统、器官和组织的恶性血液病。临床可见不同程度的贫血、出血、感染发热以及肝、脾、淋巴结肿大和骨骼疼痛。据报道,我国各地区白血病的发病率在各种肿瘤中占第六位。更为严重的是儿科恶性肿瘤的发病率中居第一位。目前已经成为严重威胁人类健康和生活的一种多发病和常见病。随着医学的快速发展,治疗白血病的方法日新月异。目前治疗白血病的方法主要有以下几种:基因治疗、抗血管生成治疗、干细胞治疗、诱导分化及凋亡、内分泌治疗、免疫治疗、移植治疗和靶向治疗。其中移植治疗可以获得较好的生存效果,但移植物抗宿主病等并发症可能严重影响患者的生活质量。因此,选择性的免疫治疗和各种分子靶向治疗是将来治愈白血病的希望,例如肿瘤疫苗、细胞治疗、细胞信号通路调节剂等。TGFβ(Transforming growth factor beta )在1978年由DeLarco和Todaro发现,最初被命名为“肉瘤生长因子”,后来更名为“转录生长因子”是因为这些分子赋予未转化的指示剂成纤维细胞与肿瘤转化相关的功能特性的能力。[1,2]TGFβ被认为有多向性的调控作用,因为他们已经被证明在大多数有关控制体细胞组织的发展和更新的过程中有调控作用。[3]Sporn和Robert指出:TGFβ可能被认为是“原型的多功能信号分子”,在增殖、分化和细胞死亡中发挥着积极或者消极的作用。[4]TGFβ/SMAD信号通路参与多种生理或者病理过程,大量实验表明TGFβ/SMAD信号通路不但能调控脂肪的生成、调控皮肤创伤的修复以及肾纤维化、肝纤维化、心脏纤维化的过程。[5-8]还参与调控青光眼、糖尿病、帕金森病、多发性硬化症和多种呼吸道疾病等。[9-12]TGFβ/SMAD信号通路参与各种肿瘤调控的实验也多次被证实,例如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、黑色素瘤、结直肠癌和前列腺肿瘤。TGFβ/SMAD信号通路在肿瘤中的调控作用是双向的,在肿瘤早期可以抑制肿瘤的进展,然而在肿瘤的晚期却促进肿瘤的发展和转移。[13-17]更有研究表明TGFβ/SMAD信号通路可以调控造血干细胞及其下游的祖细胞,造血干细胞及其下游的祖细胞的基因改变可以引起血液恶性肿瘤等,例如骨髓增生异常综合征(MDS),骨髓增生性瘤形成(MPN),急性骨髓性白血病(AML),慢性骨髓性白血病(CML),慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和急性淋巴细胞淋巴瘤白血病(ALL)。[18]典型的TGFβ/SMAD信号通路包括TGFβ及其下游信号转换器SMAD的激活。[19]经典的TGFβ信号传导是由丝氨酸/苏氨酸受体激酶的配体诱导寡聚化和细胞质信号分子SMAD2和SMAD3的磷酸化启动的。尽管TGFβ从肿瘤抑制子到肿瘤启动子的转换是没有明确定义,更多的证据表明TGFβ作为肿瘤生长和转移的激活剂起重要作用。因此,TGFβ抑制剂正在被开发为抗转移治疗癌症患者。TGFβ/SMAD信号传导途径的成员是造血作用的负调节剂,并且该途径的失调被认为是白血病发生的主要贡献者。两种普遍表达的跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体,称为II型(TbRII)和I型(TbRI)受体,是TGFβ信号转导所需的。TGFβ配体首先在质膜处结合TbRII,导致形成TbRI-TbRII复合物,其中TbRII磷酸化TbRI。活化的TbRI又磷酸化SMAD2和SMAD3,然后与SMAD4形成复合物,并且当复合物形成,这种复合物移位到核以调节靶基因表达。[20,21]SMAD蛋白可以介导TGFβ从细胞表面进入到细胞核而发生转录作用,而且TGFβ受体可以使SMAD2和SMAD3磷酸化。[22]TGFβ/SMAD信号通路通常参与广泛的细胞过程,例如生长,增殖,分化和凋亡。 一旦结合TGFβ1,二聚化TGFβ型II受体募集并磷酸化磷酸化的TGFβ型I受体受体调节SMAD(SMAD2和SMAD3)由SMAD锚提出受体激活。[23]而作为TGFβ/SMAD 信号通路下游的SMAD依赖性信号在抑制白血病发生中的作用现已在骨髓和淋巴样白血病中得到证实,SMAD3可以作为白血病发生的一种抑制信号。
同向性病毒(嗜亲性病毒)整合位点-1(EVI1)基因位于人类基因组 3 号染色体(3q26.2)上[25]。1988 年 Mucenski 及其同事在提取自 AKXD 小鼠白血病细胞的 DNA 产物中发现小鼠 EVI1 基因[26]人类 EVI1 基因的 cDNA 片段由 267bp 的 5’-非编码区、3153bp 的开放阅读框和 167bp 的 3’-非编码区组成。在开放阅读框中的两个 ATG 密码子分别位于 268bp 处和 290bp 处,由于位于 290bp 处的 ATG 密码子更靠近恒定的转录起始序列(GCC)GCC(A/G)CCATGG,因此这个密码子被认为是转录起始位点。[27]EVI1 基因编码 145kDa 蛋白质,这个蛋白质可以被分成两个区域:一个是在包含 7 个锌指状结构域的 N-末端上的区域,另一个是在包含 3 个锌指状结构域和一系列酸性氨基酸的 C-末端上的区域,这两个区域被位于中间的富脯氨酸区域分开。[28]Delwel R 已经报道在体外在 N-末端上的 3 个锌指结构区域可以结合到一个有 15 个核苷酸碱基的特定序列:(C/T)AAGA(T/C)AAGATAA 。[29]但是这 3 个锌指环只有辅助功能,也仅能提供一个相对相似的 GATAA 序列而不是 GATAA,用来整合,而不是直接结合到 15 核苷酸序列上。Funabiki T 等人已经报道在 C-末端上的锌指结构域能够识别并结合到 GAAGATGAG 的特定序列上。[30]因此,EVI1 是一种有特定结合位点的蛋白质。EVI1 蛋白质也有一个拥有较短序列的同种型,这个同种型的分子量大概 88kDa,在人类和鼠体内都可检测到。这个同种型缺少与 DNA 连接的锌指结构域 6 和锌指结构域 7,因此它有不同于 145kDaEVI1 蛋白质的独特的 DNA 连接特征。[31]EVI1 的非正常表达在骨髓性造血恶性肿瘤中是很普遍的,例如在急性髓性白血病(AML)、慢性粒细胞白血病(CML)和骨髓异常增生综合征(MDS)中,而且总是由导致白血病的 3 号染色体的颠换或插入所引起。导致非正常 EVI1 表达的最普遍的染色体颠换是染色体倒转-反(3)(q21;q26)和染色体颠换t(3;3)(q21;q26),这两种颠换在 MDS/AML 病人中占到了大约 7% 到 10%。在 EVI1 表达的 MDS/AML 病人中有 10%非正常染色体 3q26 是不存在的,这表明在 EVI1 的非正常表达和 EVI1 派生的造血恶性病变中协同因子的存在。
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实验材料与方法

1.1实验材料
1.1.1 细胞株
人急性早幼粒细胞白血病细胞 HL-60 细胞株购自中国科学院上海细胞库。人类慢性髓原白血病细胞 K562 细胞株由山东省医学科学院基础所免疫室提供。人类单核细胞白血病细胞 THP-1 细胞株由山东省医学科学院基础所免疫室提供。

1.1.2 细胞培养液
1640 液体的配制:RPMI-1640 粉末与一定剂量的 NaHCO3和 Hepes 粉(购自华美公司)溶入三蒸水中混匀,于滤器中过滤,放置 4℃保存备用。双抗的配制:青霉素 80万 U 溶入 5ml1640 液,链霉素 100 万 U 溶入 5ml1640 液,全溶解后,取青霉素溶液 5ml,链霉素溶液 4ml,加入 71ml 的 1640 液中,充分混匀,此时的双抗浓度为 10000U/ml,分装后保存在-20℃备用。谷氨酰胺溶液配制:900mg 谷氨酰胺粉末,加入 30ml1640 液中,浓度为 30mg/ml.保存在-20℃备用。每配制 250ml 10%牛全培溶液,需要加入 1640液 220ml、小牛血清(或者胎牛血清)25ml、双抗(10000U/ml)2.5ml、谷氨酰胺溶液(30mg/ml)2.5ml、10% NaHCO3适量调 PH 值至 7.2。
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1.2实验方法
从山东省医学科学院基础所免疫室液氮瓶中将 HL-60 细胞、THP-1 细胞和 K562 细胞取出,放入 37℃恒温水浴锅中迅速融化。融化好的三株细胞分别加入到超净工作台中三支离心管中(三支离心管中提前加入 4~5ml 细胞培养液),以 800 转/分钟的速度离心 3 分钟。弃上清,再一次每支离心管加入 4~5ml 细胞培养液,用吸管将细胞沉淀吹打均匀后,分别将三种细胞转移至细胞培养瓶或者细胞培养皿,放于 37 ℃、5% CO温箱里培养。提前四十分钟打开紫外线灯照射超净工作台。进入细胞房之前戴好口罩帽子,打开部分超净工作台玻璃窗,开排风扇和照明灯