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DNA芯片与法医生物物证检验

论文编号:lw201101261018043281 所属栏目:法医学论文 发布日期:2018年01月15日 论文作者:无忧论文网

DNA芯片是把许许多多已知的某种或某类DNA片段(作为分子探针)以阵列形式有序地点加在某种基质或载体上,形成分子探针的集群或矩阵,其中每个探针的位置是固定可寻的,犹如计算机的芯片一样。将被检测物质与芯片进行杂交,若其中含有与芯片中阵列DNA序列相配对的DNA片段时,通过检测手段把这些配对物检测出来,分析计算配对物的相对比率,就可以对被检物质做出检验或鉴定结论。DNA芯片又称为DNA微矩阵4DNA56789:88:;,$-<或基因芯片4=>?>7@6AB<,但作者认为不宜把DNA芯片与基因芯片等同起来,因为基因芯片应是针对可表达的DNA片段即外显子的,而DNA芯片则是包括了可表达与不能表达的DNA片段的全部,后面要提到的法医物证检验所用DNA芯片使用的就是不能表达的DNA片段即内含子。

DNA芯片现在是非常热门的技术,这是因为其具有许多传统方法无可比拟的优点所致,表现在:($)高通量、大规模。由于可以在一块芯片上点加排列成千上万个DNA片段,因而能做到对它们同时进行分析、比较和研究;(!)高度并行性。这体现在可对同一基因的DNA片段在同一细胞不同细胞周期或不同分化阶段、或者不同细胞、不同组织、不同器官、以及不同发育阶段、不同病变、不同诱导、不同个体等情况下的表达及功能同时进行分析及研究;(*)快速高效;(&)高灵敏度;(")高度自动化;(3)蕴藏高价值。制备DNA芯片的方法有:在基质上直接原位合成寡核苷酸点阵的原位合成法,!-,用微量点样技术将预先合成好的DNA片段直接点在基质上的微量点样法,*-,电子亲和素法,&-和流过式微通道法等。选择何种方法制备芯片要根据具体的实验和检验目的而定。根据制备方法的不同,DNA芯片又分成被动式和主动式两类。它们的区别在于杂交方式的不同,被动式芯片采用传统的杂交方法,即检测样品与载体上的探针(或称靶)基因序列结合是依靠它们相互间的互补性而自然缓慢发生的;而主动式则是通过电场的作用使结合更为迅速,因而杂交速度快,较之于被动式需要几小时甚至过夜,它可以在很短的时间内完成,缺点是制备复杂、成本高。上述电子亲和素无忧论文网法就是常用的一种制备主动式芯片的方法。主动式芯片采用的基质是硅。以美国(:?9C>?公司的该种芯片为例,其制备原理和操作流程可概括为:利用半导体微电子技术将硅片进行处理,在一定区域内制备出多个电极并在其上蚀刻出样品池,再以连接亲和素的琼脂糖凝胶覆盖在电极上,设计不同的管道以顺序把DNA探针、样品及缓冲液等引入到样品池中。把DEF测试样品或探针DNA以生物素标记,这样当这些生物素标记的样品流入样品池时,便会通过亲和素与生物素的结合反应而固定在电极上。若使电极带正电荷,则在相对应的配对DNA物质引入到样品池时,便能因DNA带负电而使其被浓缩集中,并因电荷的吸引而极快速的移动,与已被固定在电极上的DEF测试样品或探针配对结合。一般数分钟内杂交便可完成。此时将电极改成带负电荷,并提高硅片的温度,不正确的配对物便会被解离下来,而正确配对的则保持在上面,其准确率为百分之百。重复进行上面的杂交过程引入荧光标记的指示寡核苷酸片断,而后将芯片置入检测仪扫描,根据激发产生的荧光强度进行计算,做出分析判断,即能得出有意义的结论。上述提到的标记荧光物质现在常用的一般是E;*和E;",对于以指示寡核苷酸片断激发荧光进行计算分析的一个更有意义的改进是在制备探针样品和DEF测试样品时就分别引入E;*和E;"荧光染料,这样就能既省去后面的重复杂交过程,又可使计算分析出的结果更加准确可靠。

需要指出,主动式芯片一个电极对应一个测试点(由一个电极和其相连的极细微线路构成),一个芯片可含有许多个比如(:?9C>?公司的有//个测试点,而每个测试点又均可独立控制。这样,通过设定程序,就能任意编排和引入不同的样品或探针于不同的测试点上,能够同时或分次让不同的基因进行杂交,并可随时跟踪和记录各测试点的情况,因而能做到同时对多个基因进行检测。通常商品主动式芯片是一个已在电极区蚀刻出了样品池并以连接了生物素的琼脂糖对其进行了覆盖的即时可用芯片。至于芯片作何用途则取决于使用者,体现出其在使用上的灵活性。被动式芯片的制备原理和操作流程与主动式芯片如前所述并无大的不同,但对于制备基因芯片或称表达谱芯片则稍有不同,其商品芯片不是如主动式芯片那样是不含DNA物质的,而是含有某个(类)已知基因的DNA阵列,因此每个成品化的商品芯片实际上在其制造时就已决定了其只能作何种应用。其使用方法是根据不同的基因表达谱芯片,通过反转录制备相应的参比和测试7DNA,并同时将E;*和E;"分别引入到新合成的参比和测试7DNA分子中,混合这两种7DNA分子并将它们与芯片杂交,以激发荧光扫描仪分析判读,进行数据处理和分析,计算每个杂交点两种荧光强度的比值,即E;*:E;",即能确定基因表达有无异常,一般地,比值在#0"G!范围内表示无异常,H!为增高,I#0"为下降。法医生物物证检验所用的>4?芯片与表达谱类芯片是不相同的,这是因为表达谱类芯片检测分析的都是可表达的基因,即所谓的外显子。而能用于法医物证检验的>4?芯片则只能是不表达的>4?片断,即内含子。只有这些内含子片断才会有高度的变异性,有较高的个体差异,体现出更高的个体识别率。现在的>4?检验技术所涉及的无一不是这样的一些编码或非编码区的内含子片断。因此制备法医物证检验的>4?芯片就不能通过反转录合成0>4?的方法来获得要分析鉴定的>4?片断,而只能以@AB扩增的方法来得到。这样一来,也就无法使用已预先点加>4?片断的表达谱类芯片,而只能是检验者自己按主动式芯片的检测方法做一张芯片;又因为法医物证检验是通过对来自现场的材料与嫌疑人的进行分析比对,给出排除、不排除或认定的结论,故预先点加>4?片断的表达谱类芯片也是毫无意义的;再者由于物证检验应当越快越好,越准确越好,而制备被动式芯片则耗时太长,精确度也相对要低,故从这一角度讲,也是选用电子式主动芯片为佳。

综上所述,并借鉴主动式和表达谱类芯片的制备及检测原理,法医物证检验的>4?芯片可以按如下方法和步骤来制备和检测:(9)提取现场材料和嫌疑人的>4?;(!)按相同条件进行@AB,扩增来自现场材料和嫌疑人的特定位点C或称基因座D的>4?片断,并同时分别引入不同的荧光染料等标记物质;(E)将@AB扩增的现场材料或嫌疑人的>4?片断藕连生物素;(=)藕连生物素的扩增>4?片断通过亲和素连接于芯片上;(")未藕连生物素的扩增>4?片断与藕连生物素的扩增>4?片断进行电子杂交;(#)芯片置入扫描仪等检测装置,分析实验结果,根据荧光强度比值,做出鉴定结论。由上述分析可见,以芯片进行>4?鉴定要比现在所用的方法简单得多,也快得多(主动式芯片),但由于芯片在目前无忧论文网还基本上是一次性的,难以重复使用,因而成本高,而用于检测的扫描仪又极昂贵,且需要进口;再者虽然法医物证芯片分析要比表达谱简单得多,但若有一套好的软件分析判读实验结果将会更好,而目前这些都还没做到,故其广泛应用还尚需时日,还会有一段路要走。但随着这一技术的普及,尤其是新技术的建立及开发,廉价方便的仪器设备的推出及应用,成本的进一步降低,其将来取代现有方法则是必然的,所需的只是时间而已。另有不可忽视的一点是,当前由于技术和材料方面的进步使芯片的制作与检测方法表现出多样化。例如,以纳米技术合成一些可与>4?、蛋白质等生物大分子结合的荧光量子点,而这些量子点与>4?、蛋白质等生物大分子的结合是具有确定的数学关系的。这样在制备芯片时,通过把被检测或要鉴定物质的分子结合荧光量子点,那么,不仅可以对这些被检测或要鉴定的物质定性,而且可以定量。比如将现场>4?先连接到芯片上,而将嫌疑人>4?结合荧光量子点,那么根据它们杂交与否,看有无激发荧光,就可以确定结果的阴阳性;而在亲子鉴定时,可先后分别对嫌疑父(母)子(女)的>4?结合量子点,并在杂交前后测定激发荧光,看其是增加还是不变,或是计算其比值,根据需要进行数学定量,确定是否存在、或有多大程度的血缘关系。据悉国内清华大学化学系已合成出这样的荧光量子点,比如通过F(与蛋白质的巯基C G HID形成F(H的荧光量子点,还有A2H-、A)H:J&、K!LE:J&等荧光量子点纳米材料,等等。作者相信,随着芯片技术更进一步的与纳米技术或其它相关新技术的结合,>4?芯片这一对法医物证检验具有重要意义的技术必定会早日发挥其作用。