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采用Ames试验、噻唑蓝比色试验以及小鼠急性毒性试验研究Z24的毒性特点

论文编号:lw201205121743171315 所属栏目:基础医学论文 发布日期:2018年01月15日 论文作者:无忧论文网

Z24是我所正在开发的一种抗肿瘤新药,是基于BCL-2蛋白三维空间结构,通过计算机辅助设计的癌相关蛋白拮抗剂,具有良好的抗肿瘤活性,还具有较好的药代动力学特征,有可能成为一种具有全新机制和良好市场前景的新型抗癌药[1]。Z24的毒性毒理学资料在国内外尚未见报道。现采用Ames试验、噻唑蓝(MTT)比色试验以及小鼠急性毒性试验对Z24的毒性特点进行了初步研究。
1 材料与方法
1•1 受试物 1-(1′-哌啶亚甲基)-3-(2′-吡咯甲烯基)-2-吲哚酮甲磺酸盐,代号:Z24。由军事医学科学院毒物药物研究所合成,专利号:CN1365972。
1•2 中国仓鼠肺成纤维(CHL)细胞MTT比色法
1•2•1 细胞及其培养条件:活细胞能够将四唑蓝MTT代谢转化为甲簪,甲簪呈蓝色,因此对细胞毒性越小,则显色越深。所用细胞为CHL细胞。培养基为F12,补加体积分数为10%的小牛血清。在体积分数为5%的CO2和37℃环境条件下进行细胞培养。
1•2•2 MTT测定方法[2]:96孔培养板每孔加1 ml细胞悬液。预培养4 h,细胞贴壁,每孔加Z24受试溶液20μl,培养24 h后加20μl MTT溶液,再继续培养4 h,最后每孔加100μl甲簪溶解液,用多孔扫描基础医学论文分光光度计于570 nm波长处测定每孔的吸光度(A)值。每测试点重复测试3个孔,结果取均值。细胞抑制率=1-样品A值/对照A值。
1•3 小鼠急性毒性试验 试验选用昆明种小鼠,动物级别:一级,合格证号:BDW95007,体重18~22 g,雌雄各半,灌胃给药。Z24灌胃剂量为137•2、196•0、280•0、400•0和571•0 mg/kg。给药后连续14 d观察中毒症状,并用Bliss法计算LD50值。
1•4 沙门菌诱变性试验[3]
1•4•1 试验菌株:鼠伤寒沙门菌株:TA97、TA98、TA100和TA102。
1•4•2 大鼠肝S9活化系统:从多氯联苯诱导的雄性SD大鼠肝脏制备。
1•4•3 诱变性试验程序:用常规的沙门菌诱变性试验平皿掺入法[4],每测试浓度在加和不加S9条件下平行测试3个平皿。设阴性对照、直接诱变剂对照和间接诱变剂对照。
1•4•4 实验结果判断:如果受试物诱发的回变菌落数随浓度的增加而增加,且在1个或1个以上浓度下回变菌落数为阴性对照2倍以上,则认为试验为阳性反应。
1•5 统计方法 MTT比色结果用origin 5.0软件计算IC50,小鼠急性毒性试验用Bliss法,经SPSS软件计算LD50值。
2 结果与讨论
2•1 MTT比色测定结果 首先在本试验条件下检测了CHL细胞密度对MTT显色反应的影响。结果表明,当每孔细胞数为2•75×104~4•5×104时,显色适宜,细胞生长亦未受到明显抑制。因此在检测Z24试验中,每孔细胞数选用4×104。
从Z24的MTT比色检测结果可见,Z24在5~640μmol/L浓度范围内,细胞抑制率随着浓度增加而增加,经计算Z24对CHL细胞半数抑制浓度(IC50)为(71•0±11•0)μmol/L。
2•2 小鼠急性毒性试验结果 小鼠经灌胃途径染毒Z24后,主要中毒症状为竖毛、不安,闭目,尿液呈黄色,黄色稀便。临死前肌肉强直、挣扎和眼球突出。动物死亡大多发生在染毒后1~24 h之内。剖腹检查死亡动物,可见胃胀并有黄色的药物残留,肝脏呈紫黑色,肠道呈现黄染,尿液亦呈药样黄色。存活动物在观察期(14 d)内均明显增长。经SPSS软件概率单位法计算,Z24对小鼠灌胃染毒的LD50为323•8 mg/kg,详见表1。


2•3 沙门菌诱变性试验结果 鼠伤寒沙门菌诱变性试验是目前被广泛应用的致突变性试验方法,具有快速灵敏的特点,其结果对于评价受试品的遗传毒性具有重要价值。Z24的鼠伤寒沙门菌诱变性试验结果见表2。


试验结果表明,Z24在0•5~2 000•0μg/皿浓度范围内,无论有无S9活化系统均不诱发测试菌株TA98和TA102的回变菌落数明显增加。但在该浓度范围内,无论有无S9活化系统,Z24诱发测试菌株TA97和TA100的回变菌落数均随浓度增加而增加。而且在活化条件下,TA97在500•0μg/皿,TA100在200、500和2 000μg/皿浓度下的回变菌落数均为溶剂对照的2倍以上。此结果表明Z24对TA97和TA100具有致突变性,显示Z24即可诱发碱基置换突变,又可诱发移码突变。直接诱变剂Dexon和间接诱变剂2-氨基蒽在相应条件下诱发测试菌株产生的回变菌落数均超过溶剂对照组1倍以上,表明试验系统可靠。


综上所述,我们选用的Ames试验、MTT比色法和小鼠急性毒性试验是3种经典的毒理学试验方法,分别代表了基因突变,细胞毒性和整体动物毒性3个毒理学评价终点,因此,本研究结果对Z24毒性的初步评价提供了实验依据,也为其后期的全面毒理学评价提供了实验资料。特别是本研究证实Z24具有致突变性,在其将来临床应用过程中,对病人可能造成的遗传毒性作用给于重视。

 

参考文献:
[1] Fernandez Y,Espana S,Manas S,et al.Bcl-xL promotes metas-tasis of breast cancer of cytokines resistance.Cell Death Differ,2000,7:350-359.
[2] 张平,章崇杰,刘杰,等.改良MTT法检测自然杀伤细胞的活性.华西医科大学学报,1996,27:213-216.
[3] Maron DM,Ames BN.Revised methods http://www.51lunwen.org/ for the Salmonella mu-tagenicity test.Mutat Res,1983,113:173-215.