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论文编号:lw201802132113461831 所属栏目:基础医学论文 发布日期:2018年02月23日 论文作者:www.51lunwen.com

摘要:本文是基础医学论文,基础医学(英语缩写BMS),属于基础学科,是现代医学的基础。基础医学是研究人的生命和疾病现象的本质及其规律的自然科学。其所研究的关于人体的健康与疾病的本质及其规律为其他所有应用医学所遵循。(以上内容来自百度百科)今天无忧论文网为大家推荐一篇基础医学论文,供大家参考。

前 言

甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤,2010年美国甲状腺癌新发病例人数达到 44,670 例[1]。甲状腺癌较多见于青壮年人群,其平均发病年龄是 40 岁左右。甲状腺癌起源于甲状腺滤泡细胞或甲状腺滤泡旁细胞,甲状腺髓样癌(medullary thyroidcancer,MTC)则起源于甲状腺滤泡旁细胞,发生率分别是 80%、11%、3%、2%,由此可知乳头状甲状腺癌的发病率占甲状腺癌的绝大多数。此外,甲状腺髓样癌可以释放一些生物活性物质如:降钙素等[1]。甲状腺癌的发病率由 1981 年-1986年前六年间的 3.7%增加到 2003 年-2012 年后十年的 10.4%,相应的乳头状甲状腺癌的发病率由 40.6%增长到 81.3%[2]。在韩国人群中甲状腺癌正在以每年 24.2%的增长速度成为该国最常见的癌症,从 2002 年到 2010 年甲状腺癌死亡率每年以2.7%的速率升高,相比 1993 年-1995 年间,2006 年-2011 年近五年来被确诊的甲状腺癌患者的 5 年存活率提高了 22.9%[3]。总之,甲状腺癌的发病率呈现出增长趋势。随着现代医学诊疗技术的提高以及人们对健康观念意识的增加,乳头状甲状腺癌的检出率逐年升高。
目前对乳头状甲状腺癌的病因学研究,仍有一些是未知的。有研究表明:高碘、辐射暴露、慢性淋巴细胞性甲状腺炎、口服避孕药等因素对乳头状甲状腺癌的发病有一定的促进作用。但并不是暴露于这些致病因素的人群都会导致甲状腺癌的发生,这种个体差异是由肿瘤的遗传易感性所决定的。国内外对于甲状腺癌发病机理的研究工作主要致力于遗传学即肿瘤遗传易感性[4]。目前关于甲状腺癌与肿瘤遗传易感性的研究主要是基于全基因组关联性研究(Genome-wideassociation study,GWAS),研究者们采用此策略成功找到了乳头状甲状腺癌的遗传易感位点,并在不同人群中得以验证。例如 rs965513 和 rs944289 在美国[5]、日本[6]、德国[7]、古巴[8]人群中进行确认实验,结果发现这两个 SNP 位点与乳头状甲状腺癌的发病风险可能存在一定的相关性,但是在白俄罗斯[9]由于核泄漏辐射史的乳头状甲状腺癌患者可能与 rs965513 的多态性有关联性,但 rs944289与乳头状甲状腺癌的发生无关系。在中国汉族人群中对 rs2910164 进行基因分型并且收集丰富的临床病理资料,结果表明该位点可能与乳头状甲状腺癌或甲状腺良性肿瘤(Benign tumor,BN)的发病风险无关系,但是在甲状腺肿瘤向乳头状甲状腺癌转化的过程中起到潜在性作用[10]。Figlioli G[11]等人在印度人群中对全基因组关联性研究选取的45个SNP位点进行联合分析,结果发现:rs10136427 和rs7267944 可能与分化型甲状腺癌(Differentiated thyroid cancer,DTC)的患病风险之间存在较强的相关性。Celia M 在古巴人群中验证了 rs965513、rs944289和rs1801516 这3个SNP位点和乳头状甲状腺癌发病之间有相关性[12]。SW Kim 分析在韩国 rs925255 位点的基因型和 G 等位基因频率分布与乳头状甲状腺癌可能存在关联性[13]。冯发现中国华东地区与乳头状甲状腺癌的发病风险相关的 4 个 SNP 位点,分别是:rs966423、rs2439302、rs944289 和 rs965513[14]。本实验中选择了在中国南方人群中成功验证的 5 个 SNP 位点(rs966423、rs2439302、rs944289、rs965513 和 rs2910164)而且还选择了 4 个 SNP 位点( rs10136427、rs7267944、rs1801516、rs925255)在国外不同人群已经成功验证但在国内尚未报道,目的是为了探讨在中国鲁西南地区这 9 个 SNP 位点与乳头状甲状腺癌的发病风险是否有关联性。
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材料与方法

1.1 材料
1.1.1 研究对象和样本收集
该病例组的病人群体来自2015 年7 月份至2016年7 月份在山东省济宁医学院附属医院乳甲外科接受治疗的乳头状甲状腺癌患者。本实验经过医院伦理委员会的讨论通过,并且同乳头状甲状腺癌患者签署了知情同意书。所有患者均来自中国鲁西南地区的汉族人,主要是济宁及周边县市地区。病例组入组标准为:之前未接受过甲状腺疾病有关的手术或药物治疗且临床诊断经病理证实。根据研究需要收集 PTC 患者临床特征资料(可由病案室获得),包括病人姓名、年龄、性别、身高、体重、血压、血糖、肿瘤大小、肿瘤家族史、辐射暴露史及碘盐食入情况等信息,以建立完善数据库进行全面的统计分析。对照组是来自山东省济宁医学院附属医院健康体检中心,经登记和比对筛选出与乳头状甲状腺癌患者(年龄、性别、体重指数)相匹配的 100 例健康人。对照组选择标准包括:无肿瘤史、无甲状腺疾病史、无辐射暴露史、无高血压病史、无代谢性疾病等。每个入组研究对象收集清晨空腹静脉血 10mL,放于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中,上下摇匀放于 4℃实验冰箱中,用于基因组 DNA 的提取。
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1.2 方法

1.2.1 DNA 抽提
使用试剂盒法对血液样本(4℃储存的EDTA抗凝血)进行基因组DNA的提取实验。(1)DNA 抽提的原理 利用裂解混合液、蛋白酶 K 迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶,然后基因组 DNA 会选择性的吸附于离心柱内硅基质膜上,再通过一系列快速的漂洗脱水、离心的步骤,最后用缓冲液将纯净基因组 DNA 从硅基质膜上洗脱。(2)实验前准备及注意事项 新鲜血液样品在使用之前首先应上下摇匀抗凝管,使得下方沉淀与上清混合液充分混匀,然后用 1.5mlEP 管进行分装,放于-20℃或者-80℃冰箱。(注意:应避免反复冻融血液标本,否则会导致 DNA 片段较小且提取量下降,不利于后续实验操作。)DNA 提取试剂盒在第一次使用之前要在 Buffer1 和 Buffer2 分别按照要求加入无水乙醇。如果 Buffer GL 在使用前有结晶或沉淀的现象,应放 56℃水浴锅进行溶解。Proteinase K 的溶解:粉末状的 Proteinase K 12.5mg 短暂离心后溶解在 1.25ml 的 Proteinase K StorageBuffer 中,然后分装(每个 EP 管 200ul,一份存于 4℃,其余存于-20℃)。(注意:同样避免反复冻融,使用前需要提前拿出来。提前打开金属浴预热,设置好56℃,10min,转速 300 转/分。提前从 4℃冰箱拿出细胞裂解液 Buffer RBL 复温。(3)操作步骤 第一步裂解:用 1.5mlEP 管分装血液,每管 350ul,取其中一管加入 3 倍体积(1050ul)的细胞裂解液 Buffer RBL ,其余血液样本放回 4℃冰箱。上下颠倒混匀后涡旋 30s。离心 10,000 转/分 ,1 分钟。小心弃去离心后的上清液,用黄枪头吸干净残留管壁的废液只留下底部白色沉淀部分。(注意:吸的时候不要碰到底部沉淀)向上述步骤的沉淀中加入 200ulBuffer GR,混匀震荡30s,使沉淀溶在液体中。加入 20ulProteinase K,混匀。加入 200ulBuffer GL ,上下颠倒混匀 15 次,剧烈震荡 1min。目的是使样品与 Buffer GL 充分混匀,保证裂解率。56℃金属浴中孵育 10min。此时 DNA 的产量达到最大,即使延长孵育时间也不会增加产量。加入 200ul 无水乙醇,上下颠倒混匀 10 次,短暂离心。第二步 DNA 结合:将上述液体全部加入到收集管的吸附柱上,室温下静置 5min,目的是为了使得提取的 DNA 完全结合到硅基质膜上,静置时间长代表结合越彻底。10,000 离心 1min,倒掉收集管废液,将吸附柱放到另外一个干净的收集管中。第三步洗涤:向吸附柱中加入 500ulBuffer GW1, 以 10,000 转/分的速度,离心 1 分钟。然后倒掉收集管废液,将吸附柱放到另外一个干净收集管中。向吸附柱中加入 500ulBuffer GW2, 以 10,000 转/分的速度,离心 1 分钟。然后倒掉收集管废液,将吸附柱放到另外一个干净收集管中。为了提高 DNA 纯度,重复上一步。向吸附柱中加入 500ulBuffer GW2,以 10,000 转/分的速度,离心 2 分钟。倒掉收集管废液,将吸附柱放到收集管中。为了将乙醇去除,要将吸附柱从收集管中拿出倾斜放在收集管上,室温下放置 5min,彻底晾干,以免会对后续 PCR 反应产生影响。第四步洗脱:将吸附柱放进一新 EP 管中,向吸附柱中心悬滴50ulBuffer GE,室温放置 5min(可以增加产量),以 10,000 转/分的速度离心 1 分钟,即收集 DNA。为了提高 DNA 的终浓度,将上一步的 DNA 洗脱液重新加到吸附膜上。以 10,000 转/分的速度离心 1 分钟,收集纯度更高的 DNA。
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结 果.......17
2.1 研究人群......17
2.2 DNA 样品质检结果........18
2.3 各 SNP 位点