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药用蚶的活性蛋白成分及药理作用研究

论文编号:lw201709301848334455 所属栏目:医药学论文 发布日期:2018年01月23日 论文作者:无忧论文网
蚶,隶属于软体动物门双壳纲蚶目蚶科(Arcoidae),是一类富含血红蛋白的海洋经济贝类,在东亚和南亚地区有着悠久的食用和药用历史。具有药用功效的蚶有三个基源:毛蚶属毛蚶(Arca subcrenata)、魁蚶(A.inflate)和泥蚶(A.granosa)。蚶栖息于海岸线附近的潮间带,主要分布于西太平洋、印度洋海域的中国、日本、韩国、菲律宾、泰国及马来西亚等国家,在我国分布于山东半岛以南沿海。其壳为传统中医祛痰药瓦楞子,生品具有消痰化瘀的功效;煅制品具有制酸止痛的功效。其软体部分风味鲜美常用作食疗保健,具有消痰化积,软坚散结的功效。蚶的药用历史久远,最早可追溯到汉朝末年。《名医别录》记载:“魁蛤,味甘,平,无毒。主治痿痹,泄痢,便脓血。”
后代医书对蚶的药用功效进行了更详细的记载,发现蚶还具有温中消食,润五脏,治消渴,起阳的功效。蚶是临床基础扎实、功效确切的海洋中药,运用现代科学手段进一步阐明其药效物质基础将有利于该药的研究应用,创造巨大的开发价值。蚶药用功能成分的研究起步较晚,发展缓慢。国外学者对蚶药用成分的研究很少,相关研究近乎空白。国内的相关研究开始于20世纪90年代末,国内学者对蚶的活性化学成分和药理作用做出一些研究报道。现代研究表明蚶的主要药效成分为蛋白类化合物,具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗衰老等广泛的药理作用,但是目前得到明确鉴定的活性蛋白化合物成分并不多,许多活性成分尚待确定。
海洋生物生长在高盐、高压、低温、低光照、寡营养的海洋环境中,产生了与陆地生物不同的代谢系统和机体防御系统,合成并积累了大量结构新颖、功能独特的活性物质,如萜类、多糖类、聚醚类、大环内酯类和蛋白类化合物。近年来,海洋活性蛋白化合物凭借生物活性高、特异性强、药理活性广等独特优势成为了新药研发的新蓝海。蚶作为功效确切的海洋中药,富含蛋白质,具有广阔的药用功能蛋白的开发前景。为此笔者结合本研究团队近期研究结果综述了国内外学者在其活性蛋白成分和药理作用研究情况,旨在为药用蚶的深入研究和开发利用提供科学参考。

1蚶活性蛋白成分

蚶是一类高蛋白低脂肪的海洋贝类,粗蛋白含量达到14.8%,高于牡蛎、贻贝、蛏和文蛤等其他海洋食品贝类。蚶活性蛋白成分的研究,主要见于毛蚶、魁蚶和泥蚶。近年来,随着现代生化分离技术,尤其是适用于极性大分子的层析技术的快速发展,越来愈多的活性蛋白被分离纯化,但是蛋白结构解析仍然存在诸多困难。高级结构解析需要使用先进的技术仪器,如冷冻电镜技术、X射线晶体学技术等。一级结构的确定相对简单,但也存在因为出现天然蛋白N端封闭的情况而无法得到全部氨基酸序列的情况。
因此,文献报道的天然蛋白一般只鉴定出一级结构(全部或部分氨基酸序列)和部分二级结构(α-螺旋、β-折叠)的比例关系,不包括完全的空间构象。另外,考虑到活性蛋白在生物体内丰度低,富集难度大,进一步增加了活性蛋白的纯化难度。总体来讲,蛋白化合物的分离纯化和表征往往比小分子化合物困难许多,数量远不及有机小分子化合物。最近,蚶药效活性物质的研究进展加快,目前已分离得到35个活性蛋白化合物。

1.1毛蚶活性蛋白成分

毛蚶体内含有抗肿瘤蛋白成分。本研究团队最先报道毛蚶蛋白成分具有抗肿瘤作用,并利用离子交换层析和凝胶层析的方法分离得到2个蛋白化合物,相对分子量8.2kDa的G4-2和相对分子量16 kDa的G-6,其等电点分别为6.6和6.1。经MTT实验发现,G4-2对HeLa、HL-60、KB肿瘤细胞系均具有明显的抑制作用,其IC50分别为22.9、46.1和57.7μg/mL;另一蛋白化合物G-6只对HL-60肿瘤细胞系具有抑制作用,IC50为123.2μg/mL。随后,我们又从毛蚶中分离得到一种对HeLa和HT-29细胞系具有显著抑杀作用的蛋白组分P2。Chen等运用活性追踪的方法继续从P2组分中分离纯化,得到一个相对分子量20491Da、等电点6.65,具有抗氧化、抗肿瘤活性的蛋白化合物H3。
H3是不含糖基的蛋白化合物,经MALDI-TOF/TOF-MS和de novo测序,得到了H3的部分序列:①ISMEDVEESRKNGMHSIDVNHDGKHRAYWADNT-YLM,②KCMDLPYDVLDTGGKDRSSDKNTDLVDLFELDMVPDR-KNNECMNMIMDVIDTN,③TAARPYYCSLDVNHDGAGLSMEDVE-EDK。体外抗肿瘤实验显示,H3具有显著的抗肿瘤活性,对3种人源肿瘤细胞HeLa、HepG2、HT-29具有显著的抑制活性,其IC50分别为10.8、10.1、10.5μg/mL。此外,冯婷和付莹等发现,毛蚶活性蛋白组分对A549、HCT-116、MCF-7、BEL-7402肿瘤细胞也具有一定抑制作用。
除了抗肿瘤蛋白成分,毛蚶酶解物中还含有抗氧化活性蛋白成分。王勇等利用凝胶柱层析从毛蚶中分离得到了抗氧化组分P3,其对DPPH自由基的清除作用达到EC 50 0.192 7mg/mL。吴思聪等考察了不同提取方法对毛蚶抗氧化能力的影响,结果表明,提取物利用饱和硫酸铵沉淀法除去杂蛋白后,最大限度保留SOD酶,对超氧阴离子具有显著的清除作用。
肖湘等利用硫酸铵分级盐析和柱层析的方法,从毛蚶中分离得到铜锌超氧化物歧化酶。该酶由两个亚基组成,每个亚基含有一原子铜和一原子锌,相对分子量为28.8 kDa。此外,Song等考察了3种水解酶和酶解条件,确定了碱性蛋白酶酶解产物抗氧化活性最高。李婷菲等利用碱性蛋白酶水解毛蚶,在消除自由基活性指导下,利用离子交换层析、凝胶过滤层析、反相高效液相层析分离得到2种抗氧化肽A-Bg1、A-Bh,2者皆具有一定的清除DPPH的功能。
此外,张亚南等尚从毛蚶中分离纯化出两种血红蛋白HbI和HbII,并克隆获得了组成血红蛋白的三个亚基HbI、HbIIa、HbIIb的全长cDNA序列。通过酶活性检测发现,HbI、HbII对L-DOPA、儿茶酚、对苯二酚这3种底物具有类酚氧化酶活性。荆昭等对毛蚶血红蛋白体外抑菌活性的研究显示,HbI、HbII对3种革兰阳性菌,金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和四联微球菌均具有抑菌作用。进一步对毛蚶Hb抗菌机理的研究发现,2种血红蛋白的抑菌作用是通过产生可被超氧化物歧化酶特异性抑制的ROS而实现。

1.2魁蚶活性蛋白成分
迄今,国内外学者已从魁蚶中分离得到8种具有不同生物活性的蛋白化合物,其中5种蛋白与抗菌活性有关。Li等通过魁蚶EST标签和RACE技术鉴定出一种魁蚶防御素Sb-BDef1。RT-PCR结果显示,Sb-BDef1在魁蚶组织中均有分布。在鳗弧菌刺激8h后,Sb-BDef1在魁蚶血淋巴中的表达显著上调;16h后,Sb-BDef1在魁蚶肝脏中明显增多。这些结果揭示Sb-BDef1在革兰阴性菌侵袭机体时,发挥了免疫防御剂的功能。Mao等利用EST标签和RACE技术从魁蚶中鉴定出一种脂多糖结合的杀菌蛋白Sb-BPI/LBP1。Sb-BPI/LBP1由463个氨基酸组成,N端包含一个可与脂多糖结合的BPI1结构域。
通过RT-PCR检测发现,Sb-BPI/LBP1分布在魁蚶全部正常器官中;脂多糖刺激后,Sb-BPI/LBP1在体内含量明显增多,证实Sb-BPI/LBP1参与了宿主免疫防御,抵抗革兰阴性菌的侵袭。此外,李伟等通过缓冲液抽提、硫酸铵沉淀和柱层析技术分离得到了相对分子量为76.2 kDa的魁蚶防卫素。经抗菌活性检测发现,魁蚶防卫素对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、产气杆菌、变形杆菌均有较强抑制作用。Zheng等构建了魁蚶转录组文库,利用RACE技术克隆鉴定了魁蚶铁蛋白SbFer,并异源表达得到了重组SbFer。RT-PCR检测发现,在鳗弧菌刺激后,SbFer在魁蚶体内表达显著上升,说明SbFer作为一种免疫防御剂参与了宿主免疫防御A