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新型呼肠病毒 BYD1 株诱导细胞凋亡的分子机制及其与致病性关系的研究

论文编号:lw201704121432169582 所属栏目:预防医学论文 发布日期:2018年01月15日 论文作者:无忧论文网

前 言


呼肠病毒颗粒为无包膜的二十面体结构。其外层衣壳网格(outer capsidlatice)的主体由 600 个 μ1 蛋白以三聚体形式构成。μ1 蛋白是病毒颗粒的穿膜蛋白,它与 σ3 紧密联结,并受到 σ3 蛋白的保护。σ3 蛋白也一同构成病毒衣壳。σ1 蛋白是病毒黏附蛋白(attachment protein),呈纤维状,共36 个,它们以三聚体形式位于毒粒外衣壳的 12 个顶角上,介导病毒对宿主细胞的入侵。呼肠病毒对宿主细胞的感染首先以黏附蛋白 σ1 结合细胞受体开始,然后病毒颗粒以酷似受体介导的内吞方式进入细胞,形成胞内小泡(endocyticvesicles)。在胞内小泡中产生了与感染性亚病毒颗粒(infectious subvirionparticles, ISVPs)极为相似的颗粒。然后病毒颗粒从胞内小泡穿过细胞膜进入宿主细胞。穿膜过程主要由外层衣壳蛋白 μ1 起作用。该蛋白在病毒颗粒成熟阶段就切割成两部分,其中的 μ1N 释放出的疏水肽段在病毒颗粒的跨膜机制中起到重要作用。这种穿膜方式也是许多无包膜病毒穿膜的主要机制。穿入胞浆时,呼肠病毒核心(the reoviral core)保持完整状态。呼肠病毒核心是病毒颗粒的内部结构,它含有基因组全部十个片段,并组织它们合成、修饰、输出病毒 mRNA。一旦进入胞浆后,具有转录活性的病毒颗粒会解聚,同时合成正链 RNA 用来当作新的病毒蛋白翻译的模板 mRNA 或合成双链病毒基因组 RNA。mRNA 最终到达宿主细胞核糖体,在那里根据 mRNA合成病毒蛋白。
呼肠病毒在体外可诱导多种细胞系凋亡。推测凋亡的发生可能不经过病毒颗粒复制的完整周期,而是与病毒结构蛋白 μ1 和 σ1 的诱导密切相关。呼肠病毒诱导的细胞凋亡通路涉及死亡受体介导的胞外信号通路和线粒体途径的胞内信号通路[19,20]。通过死亡受体介导的凋亡起始于受体和配体复合物的形成,这一过程中受体寡聚化,产生死亡信号并让起始胱冬酶(Caspase-8)活化,活化的 Caspase-8 将死亡信号进一步传递下去。线粒体凋亡途径则需要特殊信号的参与,使前凋亡分子(包括细胞色素 c)从内膜系统释放出来[21]。死亡受体的活化与线粒体凋亡途径不是相互排斥的,它们在许多层次上相互交叉[22]。呼肠病毒感染细胞后的早期事件决定细胞凋亡的发生,对这两个蛋白诱导细胞凋亡功能的认识将对了解凋亡起始的早期事件(proapoptotic initiation)非常关键。本研究将对新型呼肠病毒 BYD1 株的 σ1 蛋白和 μ1 蛋白诱导细胞凋亡的能力进行研究,为阐明 BYD1 株病毒诱导细胞凋亡的分子机制奠定基础。

另外研究发现,呼肠病毒感染造成动物中枢神经系统和心脏病变。尽管已有报道指出呼肠病毒感染造成的组织损伤与其诱导的细胞凋亡有密切联系,但仍缺乏呼肠病毒诱导的细胞凋亡导致动物器官病变的直接证据。为了研究新型呼肠病毒 BYD1 株诱导的细胞凋亡与致病性的关系,我们将BYD1 病毒注射乳鼠,通过对感染乳鼠的表征观察、组织病理观察和组织原位凋亡分析,探讨呼肠病毒诱导的凋亡在组织损伤中的作用。

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第一部分 新型呼肠病毒 BYD1 株诱导细胞凋亡的分子机制的初步研究


第一章 BYD1 株病毒诱导细胞凋亡能力研究
诱导细胞凋亡是许多病毒重要的致病机制。已知某些哺乳动物呼肠病毒可以在体外诱导多种细胞凋亡[11,12,13]。BYD1 株病毒为本实验室从 SARS患者标本中分离得到的新型呼肠病毒,本章研究主要探讨其是否具有诱导细胞凋亡能力。我们首先对 BYD1 株病毒进行毒力滴定,然后用不同滴度 BYD1 株病毒感染 HeLa 细胞检测细胞凋亡率。凋亡的检测采用碘化丙啶(PI)和异硫氰酸荧光素(FITC)标记的 Ca2+依赖性磷脂结合蛋白(Annexin-V)对细胞染色,然后经流式细胞仪检测得到细胞凋亡率。Annexin-V 是一种分子量为35-36KD 的蛋白,能与细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)高亲和力特异性结合。PS 正常位于细胞膜的内侧,在细胞凋亡早期它外翻到细胞膜表面,暴露在细胞外环境中。在凋亡中晚期,细胞膜结构被破坏,PI 能进入细胞使细胞核红染。流式细胞仪通过对荧光信号的检测来反映细胞凋亡的情况。通过对细胞凋亡率的统计分析,判断病毒是否显著诱导细胞凋亡。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病毒株
新型呼肠病毒 BYD1 株为本实验室 2003 年从 SARS 确诊患者咽拭子标本中分离、经 2 次空斑纯化后保存。
1.1.2 细胞
人成纤维细胞,HeLa,本室保存;
小鼠成纤维细胞,L929,本室保存;
1.1.3 主要培养基和液体
(1)D-MEM 培养基

取少于总体积 5%的去离子水,在室温(15~30℃)融化固体培养基,温和搅拌。每升培养基加 3.7 克 NaHCO3。搅拌使完全溶解。用 1N 的 NaOH或 HCl 将 pH 值调到比所需的最终小 0.2~0.3 个 pH 值。加水至终体积,开始过滤。

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第二章 新型呼肠病毒BYD1 株结构蛋白σ1 和μ1 基因重组质粒的构建和表达
σ1 蛋白是呼肠病毒结构蛋白,呈纤维状,共 36 个,以同型三聚体形式位于病毒二十面体外壳的 12 个顶角,也称为黏附蛋白。目前确切知道的是病毒通过 σ1 蛋白结合细胞表面受体和细胞表面糖类分子来介导病毒入侵细胞。σ1 蛋白除了影响病毒的组织亲嗜性,感染后的亲噬路径(route of spread)以及致病性外[Barton ES , 2001],还成为影响病毒诱导细胞凋亡的因素之一。σ1蛋白呈纤维状,其球状头部有两个独立的细胞表面受体结合区域,分别为连接粘附分子(junction adhesion molecule, JAM)结合域和唾液酸分子(α-linked sialic acid, SA)结合域[25],不是所有毒株都同时具备这两个结合域,而且不同毒株的这两个结构域的分布和结构不同。σ1 蛋白结构上的差异影响病毒诱导细胞凋亡的能力[11,24,25]。σ1 蛋白是否单独具有诱导细胞凋亡的能力还有争议。因此,关于 σ1 蛋白诱导细胞凋亡的认识还不清楚,凋亡起始的机制依然未知[Kominsky DJ,2002]。由于 BYD1 株病毒 σ1 蛋白氨基酸序列与所有已知呼肠病毒的同源性都很低,最高为 64%[18],所以我们选取全长 σ1 蛋白来研究其诱导细胞凋亡的能力。

μ1 蛋白是呼肠病毒的又一个结构蛋白。600 个 μ1 蛋白以同型三聚体形式构成呼肠病毒外层衣壳网格(outer capsid latice)的主体,μ1 蛋白是病毒颗粒的穿膜蛋白。μ1 蛋白与 σ3 蛋白紧密联结,受到 σ3 蛋白的保护。2006 年 Danthi 发现呼肠病毒经抗 σ1 单抗处理后,感染只有 Fc 受体而没有 JAM 和 SA 受体分子的 CHO 细胞,结果仍导致细胞凋亡。说明在病毒诱导细胞凋亡过程中 σ1 蛋白并非必须[26]。同年,Coffey 等人发现 1 型呼肠病毒 T1L 株的 μ1 蛋白单独即可诱导细胞凋亡,这也是迄今为止仅有的一篇关于 μ1 蛋白诱导细胞凋亡的报道[23]。呼肠病毒 μ1 蛋白在体内被不同方式切割为三个主要的区域,分别为:①μ1N 末端区,为 2-41 氨基酸残基部分。这一片段在大部分 μ1 蛋白合成后被自我催化切割掉。②中心片段区 δ,为 42 -581 氨基酸残基;③C-末端区 φ,为 582 – 708 氨基酸残基(见图 1-2)[27]。Coffey 发现,除 μ1N 末端区外,其它片段均不同程度地诱导 CHO 细胞及 CV-1 细胞凋亡。尤其 μ1(1-675)片段诱导细胞凋亡能力最强[23]。μ1(1-675)片段包含 μ1N 末端区、δ 区以及 φ区的一个 α 螺旋。本研究选取全长 μ1 蛋白、μ1 蛋白的 φ 片段以及 μ1(1-675)片段。所选的 3 个蛋白片段包涵了 μ1 蛋白 3 个主要的存在形式。

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第一部分 新型呼肠病毒BYD1株诱导细胞凋亡的分子机制的初步研究...............9
第一章 BYD1株病毒诱导细胞凋亡能力研究........................................9
第二章 新型呼肠病毒BYD1株结构蛋白σ1和μ1基因重组质粒的构建和表达..........15
第三章 新型呼肠病毒BYD1株结构蛋白σ1和μ1诱导细胞凋亡的功能研究..........30

第二部分 新型呼肠病毒BYD1株诱导细胞凋亡与致病性关系研究....................41


第二部分 新型呼肠病毒 BYD1 株诱导细胞凋亡与致病性关系研究


Goody RJ 等人发现,注射大剂量(5×106PFU)III 型呼肠病毒 T3A 或者 T3D,能够导致 90% 的 1 日龄乳鼠出现急性松弛性瘫痪[35]。DeBiasi 等人研究指出,抑制 III 型呼肠病毒诱导的细胞凋亡可以显著减轻因呼肠病毒感染造成的新生小鼠心肌炎[36]。因此认为呼肠病毒感染造成的组织损伤与其诱导的细胞凋亡有密切联系。为了认识新型呼肠病毒 BYD1 株诱导细胞凋亡与致病性之间的关系,我们将 BYD1 株病毒经颅腔注射乳鼠,通过对感染乳鼠的表征观察、脏器病理观察和组织原位凋亡检测来研究 BYD1 株病毒感染所造成的组织损伤,以及损伤与细胞凋亡间的关系。


1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病毒株与细胞株
新型呼肠病毒 BYD1 株,本实验室保存。
1.1.2 实验动物
昆明种乳鼠,2 日龄内,SPF