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基于纳米颗粒的分子展示应用于超灵敏检测

论文编号:lw201411132159244059 所属栏目:医学检验论文 发布日期:2018年01月15日 论文作者:无忧论文网
1 引言

1.1 背景介绍
检验技术在当今医学上起着举足轻重的作用:未发病期间,可以通过各项体检指标所提供相关信息,对潜在的疾病起到预防作用;病因诊断期间,通过特定相关指标检验,更确切地查明病因,对症下药;疾病治愈后,通过检验可以起到反馈作用,根除病症。目前,检测技术日益完善,例如:酶促发光分析,化学发光、酶连免疫吸附分析、微球免疫比浊等都是常用的检测技术,特别是基于全自动生化分析仪,是检测更简洁,更快速,更准确。然而这些现有的检测技术仍存在局限性,特别在某些重要的生化指标检测上,表现出相对灵敏度不够高,很难达到对体液中低丰度生化指标的准确检测[1-6]。所以超灵敏检测技术的研究与开发在医学检测中具有重大意义,是检测技术研究的重要方向。
早在 2006 年有报道在豇豆花叶病毒(cowpea mosaic virus,CPMV)表面同时偶联荧光染料和特异性抗体,如图 1-1 所示。这种复合结构同时展示了作为靶标分子捕获器的特异性相关抗体和作为信号分子的荧光染料,将其应用到对相应的抗原检测中,能够检测出低丰度的抗原分子,很大程度提高了其检测灵敏度,使得其检测下限达到 1ng/mL[7]。
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1.2 理论依据
纳米材料具有显著的特征,表现为具有较大的比表面积和特殊的光、电、磁以及催化性质。将纳米颗粒应用到分子展示中,使得被展示的分子具备了纳米材料的性质,特别是富集效应和大的比表面积作用,使得被展示的功能性分子的功能效果得到增强。众多的纳米颗粒材料中,天然蛋白质为基础的纳米材料由于其特殊的性质备受重视,其具有多级结构可自发折叠、聚合、组装;其为一种信息驱动型的纳米结构,易于修饰和改造[9-11]。HBV 病毒样纳米颗粒和铁蛋白笼形结构纳米颗粒是基于蛋白质基础元件的很重要的两种纳米颗粒。目前针对这两种纳米颗粒的研究较为成熟,各项基础性结构也较为清晰,为进一步将其作为纳米材料运用到实际的研究中提供了理论依据。
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2 基于 HBV 病毒样纳米颗粒分子展示的超灵敏检测

HBV 为乙型肝炎病毒,出现出典范的球状布局如图 2-1 所示,具备纳米颗粒的布局底子,被遍及地用于特定功效性分子的展示[29]。HBV 条理清楚:病毒颗粒直径在 40 nm左右,呈球状,最外层是包膜,被包膜包裹的是病毒的二十面体焦点,直径约为 27nm;病毒焦点内部重要为病毒核酸,同时在病毒焦点中含有 DNA 聚合酶等酶类。其清楚的条理为进一步将 HBV 病毒颗粒作为纳米东西奠基底子。
1970 年首次在电子显微镜下观察到 HBV 的形态,其主要以三种形式存在:小球形颗粒与管状颗粒,直径约为 22 nm,管状颗粒长度为 100~1000nm 之间,此两种颗粒仅由脂蛋白组成,无感染染性;而另一种呈大球形颗粒状,称 Dane 颗粒,直径约 42 nm,具有 HBV 完整的病毒空间结构,具备感染能力,如图 2-2 所示 HBV 的不同电镜形态。
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2.1 材料与方法
2.1.1 实验材料
(1) 试剂与仪器
Pyrobest DNA 聚合酶(Takara)、Phusion 高保真 DNA 聚合酶(NEB)、DNA Marker(TransGen Biotech)、蛋白质 Marker(Fermentas)、dNTPs(Takara)、限制性内切酶(Takara)、T4 DNA 连接酶(Takara)、小量质粒抽提试剂盒(Omega Bio-Tek)、PCR 产物回收试剂盒(Omega Bio-Tek)、核酸胶回收试剂盒(Omega Bio-Tek)、蛋白浓度测定试剂盒(Bio-Rad)、BCAProteinAssay Kit(Pierce)等。
其它药品试剂,如:(NH4)2SO4、CaCl2、NaOH、HCl、丙三醇、琼脂糖、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、乙二胺四乙酸(EDTA)、异丙基-β-D 硫代半乳糖苷(IPTG)、无水乙醇、医用酒精等为实验室常规药品试剂。
培养基及试剂的配制(均使用 ddH2O 配制):
LB 液体培养基:1%胰蛋白胨,0.5%酵母提取物,1%氯化钠(NaCl),121 ℃高压蒸汽灭菌 15 min,室温保存备用。
LB 固体培养基:1%胰蛋白胨,0.5%酵母提取物,1%氯化钠(NaCl),1.5%琼脂粉,121 ℃高压蒸汽灭菌 15 min,室温保存备用。
SOC 培养基:2%蛋白胨,0.5%酵母膏,0.05% NaCl,2.5 mmol/L KCl,10 mmol/LMgCl2,20 mmol/L 葡萄糖,108 ℃高温灭菌 30 min,室温保存备用。
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3 基于铁蛋白笼型纳米颗粒分子展示的超灵敏检测.............. 49-67 
3.1 材料与方法........................... 49-55 
3.1.1 实验材料................. 49-50 
3.1.2 实验方法 .......................50-55 

3.2 结果与分析

3.2.1 重组质粒的构建
(1) pET28a-rHF 重组质粒的构建
以 pET28a-F-H-Chain 为模板,PCR 扩增出 rHF 的编码基因,通过 1.2%琼脂糖凝胶电泳观察,结果如图 3-4 所示,得到的条带大小均为 500 bp 左右,符合期望的 552 bp。
将 pET28a 和 rHF 编码序列分别经 BamHⅠ、XhoI 双酶切,并经过 1.2%琼脂糖凝胶电泳观察,结果如图 3-5 所示:L1 泳道为 rHF 双酶切后的电泳图,为 500 bp 左右的一条带,符合期望结果;L2 泳道为 pET28a 编码序列双酶切后的电泳图,为大于 5000 bp的一条带,说明 pET28a 被完全酶切成线性结构。由此得出成功双酶切 pET28a 和 rHF编码序列。
pET28a-rHF 经 BamHⅠ、XhoI 双酶切,并经过 1.2%琼脂糖凝胶电泳观察。如图 3-6所示:大于且接近 500 bp 处有目的基因片段 rHF(552 bp)。进一步测序验证,结果与目的基因序列相同,成功的将 rHF 编码序列插入到 pET28a 上。
以 pET28a-F-H-Chain 为模板,PCR 扩增出 rHF-BAP 的编码基因,通过 1.2%琼脂糖凝胶电泳观察,如图 3-7 所示:得到的条带大于且接近于 500 bp,符合期望的 597 bp。由此得出成功扩增出 rHF-BAP 编码基因。
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结论

检验技术的研究与开发,能够深化和补充目前医学检验技术中的不足。其中超灵敏检测以及低丰度的生化指标检测在当今检测技术的研究中显得尤为重要。本研究中主要以 HBV 病毒样纳米颗粒以及铁蛋白笼形纳米颗粒为材料对象,将检测相关的功能性分子展示在纳米颗粒上,构建出可用于分子检测的功能性纳米颗粒复合体,并实现对HIV-1 的 P24 抗原高灵敏的检测。为进一步开发其他生化指标的超灵敏检测以及超灵敏检测提供技术基础。
4.1 HBV 病毒样纳米颗粒的分子展示与超灵敏检测
HBV 一直被当做人类重大宿敌之一,在各个实验室纷纷致力于克制这种病毒的时候,其颗粒结构作为一种纳米材料悄然登上科研的舞台,作为一种纳米展示载体应用到各个领域,特别是对于分子检测研究中的应用。通过基因工程手段,体外获得 HBV病毒样纳米颗粒自组装的基本元件,并成功构建 HBV 病毒样纳米颗粒的自组装技术平台。此平台的建立对下一步功能性的展示以及实际的应用均有广泛的意义。
基于 HBV 病毒样纳米颗粒体外自组装的技术平台,对 HBV 病毒样纳米颗粒自组装基本元件进行功能性分子结合改造,使的 HBV 病毒样纳米颗粒表面展示金黄色葡萄球菌的 Protein G (SPG),构建出表面具有多个 SPG 分子的 HBV 病毒样纳米颗粒,其不但获得了 SPG 与抗体广谱性结合的能力,由于分子聚集效应和微环境排列效应等,使得其与抗体结合的能力存在一定的提高。将展示 SPG 的 HBV 病毒样纳米颗粒应用到HIV P24 的检测当中,与商业化 ELISA 试剂盒检测效果相比较,基于 HBV 病毒样纳米颗粒的 SPG 展示提高了十倍,可以用于检测低丰度的分析指标。
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参考文献(略)