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鹿角多肽的分离纯化及成骨活性药学研究

论文编号:lw201801311743345983 所属栏目:药学论文 发布日期:2018年02月03日 论文作者:www.51lunwen.com
引 言

鹿角为鹿科动物马鹿或梅花鹿已骨化的角或锯茸后翌年春季脱落的角基。鹿角入药,自古因循。《本草纲目》:“鹿角,生用则散热行血,消肿辟邪;熟用益肾补虚,强精活血。”鹿角胶作为鹿角的主要提取物,药用已近二千年。《本草图经》:“鹿,年岁久者,其角坚好,煮以为胶,入药弥佳。”性温味咸,有补肾阳、益精血、强筋骨、调冲任、固带脉之能。《神农本草经》将其列为上品,称之为白胶。“益气力,强骨髓,补绝伤。”因其独特且多样的药理作用及能够迅速被吸收利用的优点,使得鹿角胶的应用领域不断拓展,并且在保健和许多疾病治疗中发挥着重要的作用,从而逐渐受到人们的重视。同时存在着难以透过生物膜,生物利用度低,不宜与细胞直接吸收和利用的问题。鹿角多肽是从鹿角中分离得到的一类分子量在 0.2kDa 与 10kDa 之间的具有生物活性的多肽[2]。在人体内与细胞进行直接交换的营养物质多是一些氨基酸、无机盐、小分子量的蛋白质或多肽类物质。尤其是多肽,它们参与调控各种生理功能,在临床应用上具有非常重要的开发价值。鹿角胶中含有蛋白质、氨基酸、无机盐等多种物质,具有良好的药理活性,但存在成分复杂、药物作用靶点不明确的难题,因此对鹿角胶进行分离、提纯等研究势在必行。目前,多肽的提取主要包括超滤法、层析法、高效液相色谱法、超临界 CO2萃取技术、电泳法和酶解法等。二十世纪 40 年代以来,酶解技术是迄今为止最为重要的生产活性多肽方法。由于不同的蛋白酶具有不同的专一性和作用位点,造成水解产物中多肽的氨基酸组成和氨基酸序列各异[3],决定其酶解产物的结构不同,进而决定其生物活性具有差异性[4]。因此采用不同蛋白酶水解鹿角胶,运用现代化的科学技术从酶解液中分离多肽,寻找出具有代表性的生物活性物质,是课题的研究目标。本课题以鹿角为原材料,采用超滤法分离提取鹿角多肽,通过单因素考察实验和星点设计-效应面法确定了鹿角酶解的最优工艺条件,选用胃蛋白酶酶解制备鹿角多肽,采用氨基酸自动分析仪测定了鹿角胶及其酶解产物的氨基酸种类及含量,并通过对大鼠 BMSCs 成骨活性的影响来考察鹿角多肽的活骨作用效果。这将有利于进一步扩大鹿角的应用,为充分挖掘鹿角多肽的药用价值和制备新型鹿角多肽-脱蛋白骨细胞支架,最终研制一种治疗骨科疾病的创新生物支架材料打下实验基础。
本课题研究分以下四部分完成:(1)在木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和碱性蛋白酶中优选出胃蛋白酶作为酶解用蛋白酶;(2)以多肽含量为指标,通过单因素和星点设计-效应面法优化制备鹿角多肽酶解工艺;(3)培养 BMSCs,并考察不同浓度鹿角多肽对细胞增殖的作用,筛选出合适浓度的鹿角多肽;(4)考察不同浓度鹿角多肽对 BMSCs 增殖、生长周期、碱性磷酸酶的影响。
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第一部分:文章综述

1 本课题的来源及研究意义
1.1 本课题的来源
本课题来源于山东省自然科学基金项目,根据项目要求,需对鹿角进行分离提取多肽,研究多肽片段对骨髓间充质干细胞成骨性的影响。在确定鹿角总肽提取工艺、确定质量标准、筛选鹿角多肽活性片段的基础上,对鹿角多肽促进骨髓间充质干细胞生长的活性进行评价。

1.2 课题的研究意义

鹿角胶为鹿科动物梅花鹿或马鹿的已骨化的角,经煎煮浓缩制成,功效为活血、消肿、益肾。前期国家自然科学基金课题研究结果表明,采用鹿角胶培养 hBMP7 基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(Bone Marrow mesenchymal Stem Cells,BMSCs),BMSCs 向成骨分化的能力得到了明显加强;前期省重点研发计划课题进行的动物实验发现,鹿角胶-脱蛋白骨细胞支架对大鼠股骨头缺血性坏死有一定程度的改善。因此,为进一步从分子水平剖析鹿角胶对“骨细胞”的影响,挖掘鹿角多肽新的应用价值,本实验拟将鹿角胶酶解,提取多肽,确定提取工艺,并筛选鹿角多肽活性片段,从分子水平阐述鹿角多肽对“骨细胞”的影响,扩展中药的用途。

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2 多肽的研究进展
近年来,多肽的生理功能愈来愈受到重视。由于结构比蛋白质简单,易被吸收、低过敏性,广泛应用在临床上,并为机体提供营养。目前多肽类产品主要有两类:一类是多肽类药物或多肽类试剂,另一类是含有功能因子活性多肽的保健食品或含有该多肽的普通食品。鹿角中含有多种生物活性物质,在临床上被用于多种疾病的治疗。由于鹿角中富含丰富的蛋白质和多肽类物质,因此对鹿角多肽的研究已成为近几年研究的热点。
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第三部分:星点设计-效应面法优化鹿角多肽酶解工艺............14
1 材料..........14
2 方法与结果..........14
2.1 鹿角胶的制备...............14
2.2 鹿角多肽的制备...........14
2.3 多肽面积的高效液相检测......15
2.4 单因素的考察...............15
2.5 星点设计-效应面法优化制备鹿角多肽.........17
3 讨论..........21
第四部分:鹿角多肽对骨髓间充质干细胞的影响..........23
1 材料与方法...........23
1.1 材料......23
1.2 方法......24
1.3 统计学处理......26
2 结果..........26
2.1 超滤鹿角多肽的结果..............26
2.2 鹿角多肽 HPLC 结果.....26
2.3 BMSCs 形态学观察.......28
2.4 鹿角多肽对 BMSCs 增殖的影响..........29
2.5 鹿角多肽对 BMSCs 生长的影响..........30
2.6 流式细胞仪分析鹿角多肽对 BMSCs 生长周期的影响..........31
2.7 鹿角多肽对 BMSCs 的 ALP 检测..........32
3 讨论..........32
第五部分:结语......34

第四部分:鹿角多肽对骨髓间充质干细胞的影响

近年来,多肽的生理功能愈来愈受到重视。由于结构比蛋白质简单,易被吸收、低过敏性,广泛应用在临床上,并为机体提供营养。鹿角胶按照星点设计-效应面法要求,通过胃蛋白酶酶解后得到了丰富多肽。高效液相图谱表明,分子量为 800-1500的鹿角多肽的含量明显高于其他组,前期研究发现分子量为 800-1500 的多肽可以直接被细胞吸收和利用,为进一步探讨鹿角多肽对 BMSCs 的影响。我们通过不同浓度的鹿角多肽对 BMSCs 增殖的影响,筛选最佳浓度。研究该浓度的鹿角多肽对 BMSCs活性的影响。超滤过程 取鹿角多肽溶液置于超滤系统,为了排除膜组件中残留水及膜材质吸附等因素的影响,超滤操作温度 22~25 ℃,操作压力<0.1MPa,待超滤膜与鹿角多肽溶液之间吸附-解吸附平衡后,从储液罐中取样为平衡液,分别用截留相对分子质量为 800 和 1500 的中空纤维超滤膜超滤进行超滤,待超滤完成后,从超滤液罐中取样 800-1500 为超滤液。称取样品 20.0mg 于 10mL 容量瓶中,用流动相定容至刻度,超声振荡 10min,使样品充分溶解混匀,用孔径为 0.2μm-0.5μm 聚四氟乙烯或尼龙过滤膜过滤后,上机进样。(色谱柱:TSKgel G2000 SWXL 300mm×7.8mm;流动相:乙腈:水:三氟乙酸为 45:55:0.1(体积比);检测波长:UV220nm;流速:0.5mL/min;柱温:30℃;进样体积:10μL)制备的样品溶液在上述色谱条件下分析。
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结语

本课题采用酶解技术,通过星点设计-效应面法获得鹿角多肽制备工艺,运用超滤技术分离鹿角多肽片段(分子量为 800-1500),考察了鹿角多肽片段对 BMSCs 细胞活性的影响。具体实施时,课题首先选取鹿角片,通过煎煮、浓缩、冻干得到鹿角胶粉末,通过 TLC 鉴定鹿角胶。分析筛选胃蛋白酶,采用星点设计效应面法制备鹿角多肽。采用微滤-超滤-纳滤膜分离实验机进行超滤分离,并经过高效液相色谱验证,最终获得不同分子量大小鹿角多肽,辐照灭菌后冷冻保存。着重检测分子量为800-1500 的鹿角多肽对 BMSCs 的影响。课题整体研究方案是将传统中医药技术和现代的酶解技术、超滤技术相结合,对鹿角多肽进行了深层次研究,拓展了鹿角的应用范围。课题在保持中医药优势特色的基础上,深入挖掘了传统中医药的科学内涵,为中药的开发应用提供了新思路。课题进行了以下四个部分的研究:
1、酶种类的确定以鹿角片为原料,参照 2015 版药典制备鹿角胶,TLC 鉴定后,选取胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶四种酶,根据鹿角多肽(分子量 800-1500)含量的多少,选用胃蛋白酶,制备鹿角多肽。
2、星点设计-效应面法优化制备鹿角多肽以酶用量、底物浓度、温度为自变量,多肽含量面积为因变量,分别进行多元线性回归和二项式方程拟合,结合最佳数学模型描绘效应面,确定最佳工艺为酶用量4%,底物浓度 6%,温度 40℃。采用高效液相色谱法进行验证。
3、超滤分离鹿角多肽,并培养传代 BMSCs微滤-超滤-纳滤膜分离实验机得到分子量 800-1500 的鹿角多肽,高效液相色谱鉴定,培养、传代 BMSCs。
4、鹿角多肽对 BMSCs 活性影响鹿角多肽对 BMSCs 进行培养,研究不同浓度的鹿角多肽对细胞增殖的影响,度为 1.261×10-1g/mL 的鹿角多肽(分子量 800-1500)可以明显增加 BMSCs 的生长周期中的增殖指数,能明显提高细胞 ALP 指数(P<0.001),增强效果明显优于空白组。
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参考文献(略)